干货！流式实验中样本制备与保存全流程指南!

外周血/骨髓：

抗凝：使用EDTA或肝素钠抗凝管收集，避免使用肝素锂（可能影响后续某些荧光染料）。

红细胞裂解：通常使用商品化裂解液（如SNR-007 红细胞裂解液(10x，不含固定剂)），室温避光裂解3-15分钟，离心去除红细胞。注意：裂解后需充分洗涤。

注意：如需分析血小板或避免活化，需特殊抗凝和处理流程。

悬浮细胞系：

直接收集细胞，用预冷的流式染色缓冲液（如含1% BSA的PBS）洗涤。

贴壁细胞系：

使用不含EDTA的胰酶或细胞刮刀轻柔处理，避免损伤细胞表面抗原。

用含血清的培养基中和胰酶，洗涤。

实体组织：

机械分散（研磨、剪碎）或酶消化（胶原酶、DNA酶等）制备单细胞悬液。

过70μm细胞筛去除团块，获得单细胞悬液。

关键：处理过程保持低温，避免细胞死亡和抗原损伤。

石蜡包埋组织：

需先脱蜡、抗原修复等特殊处理，技术难度较高，非标准流程，有选择的话一般不建议做这种样本的流式检测。

1. 封闭：用含1-5% BSA或血清（与二抗同源）的PBS，冰上封闭10-15分钟，减少非特异性结合。

2. 抗体染色：

直接法：加入荧光标记一抗，避光冰浴20-30分钟。

间接法：先加一抗，洗涤后再加荧光二抗。

3. 洗涤：用预冷流式缓冲液洗涤1-2次，去除未结合抗体。

4. 固定：如需延迟上机，可用1-4%多聚甲醛（PFA）固定，冰上或4℃避光15-20分钟，然后洗涤。注意：固定后某些荧光蛋白（如GFP）可能淬灭，且部分抗原表位可能被破坏。

5. 重悬：用300-500μL流式缓冲液重悬细胞，过35μm细胞筛后上机。

特殊样本或检测目标染色

•  胞内/核内抗原：需先进行表面染色、固定、破膜（用甲醇或商品化破膜剂）、胞内染色。

• 细胞因子：通常需先使用蛋白转运抑制剂刺激细胞4-6小时。

• DNA含量分析：用乙醇或甲醇固定后，用PI、7-AAD或DAPI染色。

1.短期保存（数小时内上机）

处理后的样本置于4℃避光保存，最好在6小时内上机。未染色或已染色的单细胞悬液可暂存于4℃。

2. 中期保存（24-72小时）

表面抗原：染色后（或染色前）用1-4% PFA固定，4℃避光可保存24-72小时。注意固定时间不宜过长（一般≤24小时为佳），以免影响荧光强度。

胞内抗原：通常固定破膜后不宜长期保存，应尽快检测。

3. 长期保存（数天至数月）

冻存细胞：制备新鲜单细胞悬液，用含10% DMSO的胎牛血清缓慢冻存于程序性冻存盒，-80℃或液氮保存。需要检测时按复苏步骤快速解冻，用含DNA酶的培养基洗涤，恢复活性后染色，注意部分抗原可能因冻存受损。

固定后冻存：某些研究显示，PFA固定后的细胞可冻存于-80℃，但可能影响散射光和某些荧光信号。

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