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如何冻存细胞，简单操作流程及注意事项
5405 人阅读发布时间：2021-10-27 15:23
如何更好的冻存细胞
我们都知道，细胞如果要长期保存，需要冻存起来放液氮保存。那怎么样冻存细胞才能保证细胞能正常复苏，不至于冻存死亡呢？下面我们就来讲讲细胞冻存应该注意的一些地方。
冻存前一定要保证细胞状态良好，细胞处于对数生长期，否则不管后面怎么处理，冻存后的细胞状态必然有影响。若细胞密度偏高，培养基已经略微变黄，细胞状态正常，需要换液培养 2 h 以上再冻存细胞；若已完全变黄，细胞死亡超过 20%，需要传代后再重新培养至状态正常后再冻存细胞。
2.消化、吹打细胞按尽量轻柔
如何正确消化、吹打细胞在前面已经讲过了，有兴趣的话可以到以往文章里看看，这里就不再赘述了。冻存后细胞培养瓶和培养皿肯定还是会残留一点细胞，这些残留的细胞加新的培养基继续培养，如果培养正常就可以看出冻存时消化、吹打操作是没有问题的，如果直接死了或者状态不好，那冻存的细胞自然也好不到哪里去，问题出在哪就很明显了。
3.冻存液配方要给合适的
冻存液配方这个其实不同实验室都有自己的习惯，有 FBS+10%DMSO 的，也有完全培养基+10%DMSO 的，还有基础培养基+血清+DMSO = 7:2:1 6:3:1 5:4:1，可以说是五花八门，但总体来说，DMSO 一般是不超过 12% 的，血清浓度越高冻存效果也越好，因此需要多冻几次对比合适的配方。
4.冻存液要提前配置
冻存液使用时要提前配好，不能直接在细胞悬液中加 DMSO 冻存细胞，否则 DMSO 溶解时浓度不均加上溶解放热会损伤细胞活性。可以现配先用，也可以多配一点，4 度最多可以保存 3 个月，-20 度可以保存一年。细胞用冻存液重悬后应尽快放到 4 度或者程序性冻存盒开始冻存，避免长时间室温状态，因为室温条件下 DMSO 对细胞是有害的。
5.冻存细胞数量选择
通常来说，冻存细胞都会有一部分细胞死亡，所以冻存剩下的活细胞数量才是决定细胞复苏后能否正常养起来的关键。一般冻存不容易死的细胞数量每管在 100-200 万就够了，一些冻存很容易死的细胞，比如 NK92、THP-1、SF9 等细胞数量要稍微高点，300-400 万左右为宜。冻存液一般 1 ml 左右每管，这个基本每个实验室都差不多。冻存的时候可以选择用程序性冻存盒直接放到-80 度冻存细胞，但要记得异丙醇要及时更换，一般用 4-5 次异丙醇含水量就超标了，不再适合冻存细胞使用。也可以将冻存管依次在 4 度 10 min，-20 度 2 h，-80 过夜后液氮保存。-80 度不适合细胞长期保存，只能短期保存，最好不要超过一周，否则有部分细胞系活性可能会下降很厉害，长期保存的细胞最好放液氮罐保存。
7.注意冻存检查
以上就是冻存细胞应该注意的一些地方了，冻存细胞是很需要经验的，实在没有经验的最好让实验室有经验的人指导下，否则很容易冻存失败。有问题欢迎咨询我们（电话/微信：18571496830）。尚恩生物-您专业的细胞供应商！