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公司新闻/正文
实验干货 | 细胞支原体PCR检测及常见问题
27 人阅读发布时间：2026-09-17 10:08
细胞背景
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种在体外特异性地扩增特定DNA片段的技术，由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得诺贝尔化学奖。它的核心思路是在体外模拟生物体内的DNA复制过程，以少量DNA为模板，经多次循环以接近指数扩增的形式产生大量目标DNA分子。
01实验原理
PCR的每个循环由三个步骤构成：
-
变性（Denaturation）：高温（约95℃）加热使双链DNA解离成两条单链；
-
退火（Annealing）：低温（37-55℃）下引物与单链模板的互补序列结合；
-
延伸（Extension）：在Taq聚合酶最适温度（约72℃）下，以引物3'端为起点沿模板合成新的DNA链。
每完成一次循环，目标DNA片段数量翻倍，从而在短时间内实现指数级、数百万倍的扩增。
02实验目的
本公司试剂盒采用针对支原体16S rRNA序列保守区域设计的特异性引物（非巢式PCR法）（货号：SNCD-003），可实现细胞培养上清中支原体污染的快速、灵敏、精准检测，最低检出限低至20个拷贝。从而有效识别和防控细胞培养中常见的支原体污染，保障细胞实验数据的准确性与可靠性。
03所需试剂、耗材及仪器
客户需要自备的试剂、仪器
<1>待检测样品：细胞上清、血清或者培养基、细胞DNA。
细胞上清建议使用培养细胞3-5天的上清，培养时间过短的上清支原体含量较低可能无法有效检出，血清或者培养基也应在培养箱静置培养1-2天使支原体有一定程度增殖再用于检测；细胞悬液无法直接用于检测，需要提取总DNA后检测，添加量为PCR体系的1/20或更少。
<2>必备仪器、试剂
a.PCR相关：PCR仪、无菌PCR管、微量离心机、水浴锅、塑料浮板
b.电泳相关：琼脂糖凝胶、电泳仪、电泳缓冲液、DNA marker、DNA染色液
c.通用：移液器、无菌Tip头、离心管等
04试剂盒组分（ SNCD-003）
|
试剂货号 |
试剂名称 |
规格
|
|
SNCD-003 |
支原体PCR检测试剂盒 （非巢式PCR） |
250次（20uL体系） |
05操作步骤
1. 准备工作
A．水浴锅调制90°。
B．试剂盒复温溶解。
2. 样本处理
取待测细胞上清至EP管后放置塑料浮板上水浴5min 90°，4°备用。
3.PCR体系配置
|
试剂 |
20uL |
|
双蒸水 |
8.6uL |
|
样品 |
1uL |
|
引物 |
0.4uL |
|
PCR Mix |
10uL |
阳性对照1uL，阴性对照空白溶液或双蒸水1uL；体系配置完微量离心机离心。
PCR反应参数：
STEP1 (起始变性): 94ºC 30sec
STEP2 (变性): 94ºC 30sec
STEP3 (退火): 55ºC 2min
STEP4 (延伸): 72ºC 1min
STEP5 (循环): Go To STEP2 for 30 cycles
STEP6 (最终延伸): 72ºC 5min
STEP7 (临时保存): 4ºC forever
06实验结果
1.取PCR产物各5-10uL皆可，通过琼脂糖凝胶电泳并染色观察目的条带。由于不同类型的支原体扩增出来的条带大小不一，因此通过条带大小可以粗略判断支原体类型，如需要进一步检测确定，建议对产物进行测序比对。
2.结果示例
07常见问题
-
出现拖尾现象
其原因往往由于酶量过多、dNTP浓度过高、Mg2+浓度过高、引物浓度过高、上样量太大琼脂糖浓度不对未凝固好、电压过高、循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量、减少dNTP的浓度，适当降低Mg2+浓度。②稀释引物浓度、减少上样量。③重配琼脂糖凝胶、电泳液。④增加模板量，减少循环次数。
-
阳性对照条带未显现、检测没有参考性
引物储存不当、反复冻融相关试剂失效、电泳缓冲液陈旧失效、PCR程序设置错误（退火温度过高、延伸时间不足）等。其对策有：①相关试剂储存条件-20°冰箱，小剂量分批量保存。②重新配置电泳液。③按照厂家说明书设置PCR程序。
-
样品出现弱阳性条带
支原体含量低、取样不均、悬浮细胞沉淀收集不足等。其对策有：①待测样本密度达到70%、2-3天不做换液处理。②轻轻吹打细胞后取样。