科研干货 | 原代细胞培养纯化方法全面解析

原代细胞培养纯化的主要方法：

◆原理：利用物理方法（如切割、刮除）分离目标细胞。

◆应用：适用于组织块较大、细胞分布不均的情况，如从器官中分离特定区域细胞；适用于多种类型细胞明显成片区生长，区域细胞纯度较高。

◆操作：在显微镜下手动分离目标组织区域，避免混入其他细胞类型；在显微镜下观察，用记号笔在细胞培养瓶上勾画出杂细胞的分布区域，然后用细胞刮刀伸入瓶内，刮除杂细胞，保留目标细胞（常用于成纤维细胞和上皮细胞交错成块分布）。

√ 优点：操作简单，成本低。

× 缺点：对细胞机械损伤较大，分离效果可能不如酶消化法。

◆原理：使用胰蛋白酶、胶原酶等酶类消化组织，如胶原酶，特异性降解纤维化组织的胶原蛋白、消化肿瘤组织块，破坏来自间质的成纤维细胞，可获得较纯的癌细胞；中性蛋白酶，切割细胞外基质中的纤连蛋白和层粘连蛋白，释放单细胞。

◆应用：广泛用于贴壁细胞（如成纤维细胞、上皮细胞），适用于纤维化组织（如胰腺、肝脏）、肿瘤组织、上皮细胞和内皮细胞的分离。

◆操作：将组织剪碎后，加入适量酶液消化，通过控制消化时间和温度，使目标细胞脱离组织，

同时避免消化过度。

√ 优点：分离效率高，细胞活性好。

× 缺点：酶的成本较高，消化时间及效果难以控制，且可能对某些细胞类型有毒性。

◆原理：利用不同种类细胞贴壁速度差异性及细胞敏感性不同，通过控制培养时间差或消化时间差，可选择性移除未贴壁或弱贴壁的细胞，从而分离目标细胞。

◆应用：成纤维细胞对胰蛋白酶作用敏感，组织块或消化传代时，成纤维细胞常常先脱落；原代细胞悬液接种后，成纤维细胞贴壁速度比上皮细胞、心肌细胞快。

◆操作：将刚从组织分散的细胞悬液接种于培养皿内，于37℃，5%CO2恒温培养箱中静置培养，0.5-2h后，吸取未贴壁细胞悬液，一般先贴壁细胞为成纤维类细胞，未贴壁悬液多为上皮类细胞。

√ 优点：无需特殊试剂，操作简单。

× 缺点：分离周期长，纯度可能有限。

◆原理：利用增殖期细胞的作用敏感性，通过抑制杂细胞增殖，从而避免少量杂细胞成为优势细胞，拉大目的细胞与杂细胞优劣势差而分离目标细胞。

有些化学物质对成纤维细胞的生长有抑制作用，而对培养的目标细胞无明显影响。因此，在细胞贴壁生长或分裂后，利用这些化学物质抑制成纤维细胞生长，从而获得纯度较高的目标细胞。

 如阿糖胞苷通过抑制细胞DNA的合成，干扰细胞的增殖；嘌呤霉素作为蛋白合成抑制剂，能抑制细胞的生长。

◆应用：阿糖胞苷在神经元、心肌等不增殖细胞；嘌呤霉素在微血管内皮细胞等贴壁增殖缓慢的细胞纯化作用。

◆操作：将刚从组织分离出来的神经元细胞悬液接种于培养皿内，同时加入合适浓度的药物筛选，于37℃，5%CO2恒温培养箱中静置培养，药物作用2-5d后更换新鲜培养基。

√ 优点：操作简便，成本较低，特定细胞类型效果明显，可与其他方法联合使用。

× 缺点：细胞损伤风险较高，纯化效果有限，过程不可控，批次差异大，结果不稳定，可能影响细胞功能。

◆原理：利用不同细胞类型的密度差异，通过离心分层。

◆应用：适用于血液细胞等单细胞悬液（如淋巴细胞、单核细胞）的分离。

◆操作：将细胞悬液叠加于密度梯度介质（如Ficoll）上，离心后不同细胞层分布在不同介质层中，收集目标细胞层。

√ 优点：分离纯度高，适用范围广。

× 缺点：离心时间长，对操作技能要求较高。

◆原理：利用特异性抗体标记目标细胞，通过磁场分离。

◆应用：高纯度分离特定细胞亚群（如CD4+ T细胞、干细胞）。

◆操作：将细胞与磁珠标记的抗体孵育，通过磁场分离标记细胞，未标记细胞被去除。

√ 优点：分离纯度高，可达99%以上。

× 缺点：设备昂贵，操作复杂，成本较高。

◆原理：利用荧光标记抗体，通过流式细胞仪识别并分离目标细胞。

◆应用：高精度、高纯度分离细胞亚群（如肿瘤干细胞、免疫细胞）。

◆操作：将细胞与荧光标记抗体孵育，通过流式细胞仪分析并分选目标细胞。

√ 优点：分离效率高，细胞活性好、纯度高，分析参数多、数据全面。

× 缺点：仪器价格昂贵，操作技术门槛高，细胞容易损伤。

◆原理：原代细胞的培养成功高度依赖于专用培养基和关键生长因子的优化组合；不同细胞类型对营养成分（如葡萄糖、氨基酸）、激素（如胰岛素）、细胞因子（如EGF、bFGF）的需求各异；因此需要系统筛选和优化培养体系来模拟目的细胞体内微环境（如胶原蛋白、层粘连蛋白），促进细胞贴附、增殖或分化。

信号通路调控生长因子：通过激活特定通路（如EGF→EGFR→MAPK）促进增殖或分化；剂量依赖性：低浓度可能无效，高浓度可能诱导异常分化（如TGF-β在肿瘤中的作用）

◆应用：广泛用于原代细胞筛选。如神经元细胞：添加B27维持神经特性；干细胞：添加bFGF维持干性；肿瘤细胞：提供高糖和谷氨酰胺支持瓦氏效应（Warburg effect）；血管内皮细胞：需要包被培养皿，促进细胞贴附、增殖，添加VEGF促进血管分化。

◆操作：依据细胞增殖分化特性及信号通路需求，选择合适基础培养基，添加相关生长因子，定制专用完全培养基。

√ 优点：提高细胞存活率，减少批次变异，适用于临床级细胞实验，精准控制细胞代谢行为。

× 缺点：研发配制价格昂贵，测试验证周期长，因子添加剂价格昂贵。

在实际操作中，刚分离出的原代细胞往往纯度较低，且杂细胞种类多；后期接种培养时，需要根据目的细胞及杂细胞的特性和实时状态，运用多种纯化方法结合去培养纯化，才能达到高纯度、高活性的目的原代细胞。